产品名称：
转让重组葡激酶项目(Sak)全套技术
产品类别：未知类型
信息内容：重组葡激酶项目(Sak)简介
正式品名： 重组葡激酶
化学名： 重组金葡菌纤溶酶原激活剂
外文名： Recombinant Staphylokinase (r-Sak)
汉语拼音名： Chongzupujimei
天然的葡激酶是由金葡菌发酵产生的。我们通过重组DNA技术，由金葡菌染色体DNA中获得了克隆化的葡激酶结构基因，在大肠杆菌系统中实现了高效表达。表达产物—重组葡激酶（r-Sak）具有纤溶酶原激活作用，经发酵、分离纯化获得了单一组分的小分子Sak，其具有与成熟Sak相同的药用价值。
选题的目的与依据
心脑血管病是当今危害人类健康与生命的主要疾患之一。本项目的目的在于研制一种新型的溶解血栓剂药，用于血栓病的预防和治疗。临床上常用的溶栓剂均是直接（如：尿激酶 UK和t-PA）或间接（如：链激酶 SK）纤溶酶原激活剂。这些纤溶酶原激活剂都有一些缺点，如：t-PA稳定性差，SK由于为非人原性蛋白，诱生抗体; 较为突出的问题：是作用缺乏选择性，易引起出血并发症，尤其是颅内出血。因此，不断开发新的更好的溶栓药物是当务之急。葡激酶可望成为一种快速、高效、新型的溶栓剂。
我们自己筛选到一株产葡激酶的金葡菌，以该菌染色体DNA为模板，通过PCR扩增和DNA重组技术，获得了Sak的结构基因，实现了高效表达，构建了一株高产菌，为Sak的产业化打下了基础。
国外有关该产品的研究现状与生产及临床使用情况：
Lack于1948年报道了金葡菌产生的一种非酶蛋白，能够激活纤溶酶原转化为纤溶酶。60年代前仅就其体外纤溶性作了初步研究。Lewis等和Kanae分别于1964年和1986年用狗观察了葡激酶的溶栓情况。过去研究用的葡激酶来自金葡菌发酵，产率低，数量有限又有内毒素的污染，影响实验结果在所难免，使得多年来葡激酶的研究停滞不前。只有DNA重组技术的引入，高产工程菌的构建，最新生化技术的应用，才有可能提供大量的高纯度的重组葡激酶（r-Sak）。因此，九十年代以来葡激酶的研究才有了长足的发展。日本、德国和比利时等国都在积极开展葡激酶的研究。进行了基因克隆、酶的结构与性质、酶作用机制与纤维蛋白专一性等项工作，并从体外实验、动物血栓模型、临床实验、免疫原性等方面与链激酶（SK）进行了比较研究。
葡激酶的结构与生产
国外已分别由金葡菌溶原性转换噬菌体和染色体DNA获得了克隆化的基因。分别命名为Sak42D和SakSTAR，在大肠杆菌和枯草杆菌中都实现了高效表达。测定了基因的核苷酸序列，确定了酶的氨基酸序列。成熟的葡激酶（Sak-M）由136个氨基酸组成，同时发现NH2末端失去6个和10个氨基酸的Sak-D6和Sak-D10，同样具有生物活性，甚至Sak-D10比Sak-M具有较高的比活。有趣的是SakSTAR比Sak42D具有较好的热稳定性。高产工程菌可获得约200mg/L葡激酶。
r-Sak作用机制及其纤维蛋白专一性
葡激酶(S)像链激酶一样为非酶蛋白，与纤溶酶原(P)结合形成无活性的纤溶酶原—葡激酶复合物(P×S)。然后，转化成有活性的纤溶酶复合物(Pi×S)以此催化另一些纤溶酶原分子转化为纤溶酶(Pi)。如图1：
Pi + S
P + S P×S Pi×S
P Pi
图1：在缓冲液中
通常，Pi×S能促进P×S向Pi×S转化，更有效地将P转化为Pi。
如图2所示，P×S与P×SK截然不同。在无血纤维蛋白的血浆中,a2-纤溶酶抑制剂（a2-Ap）与Pi×S中的Pi结合导致无活性的Pi×a2-Ap（PAp）复合物形成。从而抑制S对P的活化，避免了过度纤溶酶原活化而导致的“溶血状态”（“Lytic state”）。
Pi + S + Ap PiAp + S
P + S P×S Pi×S
图2：在无血纤维蛋白的血浆中
在有血纤维蛋白的血浆中，如图3所示。P×S通过其P中的赖氨酸位点与纤维蛋白的结合，促进P的活化，血纤维蛋白的作用在于：大大抑制a2-Ap对血块上Pi×S复合物的结合，同时增强活性Pi×S复合物的产生，从而促进
P×S Pi×S转化和S由Pi×S解离出来，并参与另一轮循环。显然P的活化是在血块表面上进行的。
Pi +S +Ap PiAp + S
Fibrin
P + S P×S Pi×S +Ap PiAp + S
P Pi
图3：在有血纤维蛋白的血浆中
根据以上分析，可以绘制出一个有关Sak激活作用的纤维蛋白专一性的作用机制图。如图4所示，非纤维蛋白专一性的激活剂，如SK和双链尿激酶型纤溶酶原激活剂（tcu—PA），不论有无纤维蛋白存在的情况下，均可激活纤溶酶原，因而出现a2-抗纤溶酶抑制剂大量消耗并产生过量的纤溶酶，导致纤维蛋白原、因子Ⅴ和因子Ⅷ等血浆蛋白的降解造成“溶血状态”。Sak与SK不同，在无血纤维蛋白的情况下，由于血浆中少量的纤溶酶与a2-antiplasmin结合，不产生或很少产生Pi×S复合物，因而没有出现纤溶酶的激活作用。在有血纤维蛋白存在的情况下，选择性地激活血纤维蛋白表面纤溶酶原，在十分有效地降解血栓的同时，正常血液循环中的血浆蛋白基本上不受伤害，从而避免了“溶血状态”。
Fibrinogen
Factor Ⅴ Degradation products
Factor Ⅷ
a2-antiplasmin
Plasminogen Plasmin
Staphylokinase
Plasminogen Plasmin
图4：Sak激活纤溶酶原的纤维蛋白专一性
r-Sak与r-SK的比较研究
1. 基础性实验
以兔作实验，比较几种常用的纤溶酶原激活剂，给药120分钟后的结果。如表1：
表1：各种溶栓剂效果比较
溶掉50%血纤维蛋白时酶浓度（mg/ml） 比值（R/Sak）
r-Sak 1.8 1.0
r-SK 22.1 12.3
t-PA 2.1 1.2
u-PA 4.7 2.6
另一组实验给兔用药360分钟后的结果如表2：
表2：
溶栓50%时的酶浓度（mg/Kg） 比值 (用药量) 血液中的纤溶酶原浓度
r-Sak 150 1.0 正常
t-PA 500 3.3 正常
以125I人血块在人血浆中为材料，对r-Sak和r-SK溶解血纤维蛋白能力和纤维蛋白原降解情况。结果如表3：
表3：
溶解50%血块所需酶量（nmol/L） 纤维蛋白原降解率（%）
r-Sak 17.0 5.0
r-SK 68.0 90.0
r-SK/r-Sak 4.0 18.0
在没有血纤维蛋白块存在的条件下，在2小时内人血浆纤维蛋白原降解50%时，所需的酶量如表4：
表4：
酶量（nmol/L） 比值
Sak 790.0 180
SK 4.4 1
急毒初步观察，10只小白鼠（25g/只）按4mg/Kg r-Sak静注，8天内没有发生任何急性反应，体重未减少。
无论动物体内实验还是人血浆体外实验都一致表明：除r-Sak和t-PA外，所有的纤溶酶原激活剂，在溶解血块的适当浓度条件下，都使循环中的血浆纤维蛋白原水平明显降低。r-Sak基本上不影响纤维蛋白原和a2—纤溶酶原抑制剂的正常水平。从溶栓能力上看，依次为r-Sak>t-PA>u-PA>r-SK，r-Sak溶栓能力最强。说明r-Sak是一种安全、高效的溶栓剂。
1.动物种属的差异
以不同种动物进一步比较了r-Sak和r-SK的纤溶性。对于狒狒、狗、大鼠、田鼠等动物自体固有的血块体外实验表明，r-SK似乎是一种较弱的纤溶酶原激活因子，相反，r-Sak除大鼠外，对溶解其他动物血块非常有效。对于溶解狒狒、狗、兔、和田鼠血浆中血块的效果与人血系统相当。然而，r-Sak对狗的系统似乎过于敏感。这可用以解释60年代和80年代初期在以狗的实验中为什么会出现致死性的出血现象。
在人的血浆中对富含血小板和血小板较少的血块，r-Sak均具有良好的纤溶活性。然而，r-SK对富含血小板的血块作用甚差。与非纤维蛋白专一性相反，Sak不太作用于循环中的纤溶酶原，这一点在临床上具有十分重要的意义。在缺血过程中，由于血小板聚集而造成的心脑动脉血栓。
2. 动物血栓模型
以不同种动物血栓模型比较了r-Sak和r-SK溶栓效果。田鼠肺栓塞实验，当用富含血小板血浆血块和机械压缩血浆血块模型（compressed plasma clots），r-Sak比r-SK溶栓能力分别高5倍和2倍。对兔、狒狒颈静脉血栓，二者溶栓能力相当。而对于狗大腿静脉血栓模型r-Sak比r-SK高5倍。与r-SK相比，在狗、狒狒的富含血小板股动脉双线结扎移位造成的血栓模型（Femoral arterial eversion graft thrombosis mode）方面，r-Sak能更可靠地诱导血管再通（recanalization）。
以狗、狒狒体外循环血栓模型，在r-Sak和r-SK的免疫原性方面进行了比较。这两种动物血浆本底(baseline)均含有测得出的SK中和活性。但是，没有测出Sak的中和活性。每周给狗用药，Sak比SK产生抗体要晚。每周给狒狒用药，SK显著地增加了中和抗体，并伴随有严重的低血压，溶栓能力逐渐降低。但是，r-Sak每周给药5次，4只狒狒中有1只产生抗体，仍保持了原有的溶栓能力，也未出现低血压和过敏反应。动物实验表明：与SK比起来，Sak是一种弱免疫原性、弱过敏性、对富含血小板的血栓溶栓性高的纤溶酶原激活剂。
3. 临床实验
r-Sak在体外实验和动物模型上均获得了令人鼓舞的结果，激励着人们开展了临床研究。比利时由38位医学博士、7个医疗中心组成了r-Sak临床试验小组，开展了r-Sak临床研究。1993年以来，入试者达100多人。
给10位扩张性心梗（evolving myocardial infarction）患者，30分钟静脉注射10mg r-Sak，合用肝素和阿司匹林，10人中的9人在用药后40分钟内冠状动脉再通：8人为TIMI 3（完全灌注，complete perfusion），1人为TIMI 2（部分灌注，partial perfusion）。纤维蛋白原和a2—抗纤溶酶抑制剂保持正常水平。另有5人急性心肌栓塞患者，静注r-Sak 10mg，达到TIMI 3级所需时间：10分钟2人；15分钟1人；20分钟2人。1993年10月15日至1994年10月20日在临床上开展了大面积试验，入试者达100人，r-Sak组48人，其中25人30分钟静注r-Sak 10mg；23人30分钟静注20mg。r-tPA组52人。用药量为90-100mg，所有心梗患者同时用肝素和阿斯匹林。90分钟的实验结果，溶栓达到TIMI 3级：r-Sak组为62%；r-tPA组为58%。危险率(risk ratio) 为1.1; 95%血浆清除率为0.76-1.5。r-Sak 10 mg /人剂量组达到TIMI 3级者50%，危险率0.86；95%血浆清除率相对r-tPA为0.54-1.4。r-Sak 20 mg /人剂量组TIMI3为74%；危险率1.3；95%血浆清除率为0.90-1.18。90分钟，纤维蛋白原r-Sak组为基础水平的118±47%（mean±SD），r-tPA为68±42%（p<0.0005）。r-Sak治疗组与