蜡样芽胞杆菌检验

中国虎网 2011/12/2 0:00:00 来源: 未知

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种需氧性，能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌。本菌在自然界分布较广，通常存在于土壤、蔬菜以及许多生的和加工食品中。蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒常发生在食品供应前的加工和储存过程中未进行冷藏，使该菌在食品中得以增殖。食入含大量蜡样芽胞杆菌每克食品达到106或以上时，可引起食物中毒。
蜡样芽胞杆菌食物中毒涉及食品较多，包括剩米饭、甜点心、乳肉类食品、豆制品、蔬菜等。
蜡样芽胞杆菌所致食物中毒有两种类型。一种是以恶心、呕吐病状为主；另一种是以腹疼、腹泻症状为主。前者潜伏期较短，为1~5h；后者潜伏期较长，为8~24h。

第一节蜡样芽胞杆菌标准检验方法

一、检验方法
（一）菌数测定
以无菌操作将检样25g（或25ml）按GB 4789.2《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1~10-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在两个选择性培养基——甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上，用L形棒涂布于整个表面，置36±1℃培养12~20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽胞杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计算后，从中挑取5个这样的菌落伏证实试验。根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数，计算出该平板内的蜡样芽胞杆菌数，然后乘其稀释倍数，即得每克或毫升样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如，将固体检样的10-4稀释液0.1ml涂布于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板上，生成的可颖菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，则1g检样中蜡样芽胞杆菌为：
25×4/5×104×10=2×106
（二）分离培养
将检样或其稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养12-20h，挑取可颖为蜡样芽胞杆菌的菌落，接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，然后做证实试验。
（三）证实试验
1. 形态观察。本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位菌体中央或稍偏于一端。
2. 培养特性。本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上生成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，边缘不齐。
3. 生化性状。本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血不发酵甘露和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。
（四）生化分型
蜡样芽胞杆菌可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验，将该菌分成不同的型别。见表16-1。
表16-1 蜡样芽胞杆菌生化分型

型别	柠檬酸盐利用	硝酸盐还原	淀粉水解	v-p 反应	明胶液化
1	+	+	+	+	+
2	－	+	+	+	+
3	+	+	-	+	+
4	－	－	+	+	+
5	－	－	－	+	+
6	+	－	+	+	+
7	+	－	－	+	+
8	－	+	－	+	+
9	－	+	－	－	+
10	－	+	+	－	+
11	+	+	+	－	+
12	+	+	－	－	+
13	－	－	+	－	－
14	+	－	－	－	+
15	+	－	+	－	+

（五）与类似菌鉴别
本菌与其他类似菌的鉴别见表16-2。
表16-2 蜡样芽胞杆菌与其他类似菌的鉴别

特　　　征	巨大芽胞杆菌	蜡样芽胞杆菌	苏云金芽胞杆菌	蕈　状芽胞杆菌	炭疽芽胞杆菌
过氧化氢酶	+	+	+	+	+
动　　力	±	±	±	－	－
硝酸盐还原	－	+	+	+	+
酪蛋白分解	±	+	±	±	±
卵黄反应	－	+	+	+	+
葡萄糖利用（厌氧）	－	+	+	+	+
甘露醇	+	－	－	－	－
木糖	±	－	－	－	－
溶血	－	+	+	+	±
已知致病菌特性		产生肠毒素	对昆虫致病的内毒素结晶	假根样生长	对动物和人致病

注：+ 90%~100%的菌株阳性；－ 90%~100%的菌株阴性；
± 大多数菌株阳性；大多数菌株阴性。
本菌在生化性状上与苏云金芽胞杆菌极为相似，但后者可藉细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下：取营养琼脂上纯培养物少许，加少量蒸馏水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加0.5%碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸气维持1.5min，移去酒精灯，将玻片放置半分钟，倾去染液，置洁净自来水充分漂洗，晾干，镜检。在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体（如未形成游离芽胞，培养物应放室温再保存1~2d后再检查），如有即为苏云金芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌检查为阴性。

（六）蜡样芽胞杆菌检验程序

图16-1 蜡样芽胞杆菌检验程序

二、结果分析判定
（一）菌数测定
1. 蜡样芽胞杆菌在甘露醇卵黄胞粘菌素琼脂平板上菌落较大，因而需选取菌落数在30个左右的进行计数，超过50个以上就几乎布满整个平板，很难计数。
2. 蜡样芽胞杆菌菌灵敏的计算与一般细菌计数不同，是计算蜡样芽胞杆菌的数，其他细菌要减掉，因而要做证实试验。
3. 蜡样芽胞杆菌检验时需要计数是因为蜡样芽胞杆菌只有菌数达到106~108个/g时，才能引起食物中毒，因而在确定食物中毒或可疑中毒食品中必需做蜡样芽胞杆菌的计数。其次，在食品中限量检查时，有些国家规定熟冷盘肉中10-3稀释液不得检出蜡样芽胞杆菌，英国规定生冻鱼和冻肉的蜡样芽胞杆菌数每克不得超过103个。我国外贸合同中规定，对英出口熟虾仁春卷中不得检出蜡样芽胞杆菌，因而在食物中毒鉴定和某些食品卫生评价中，蜡样芽胞杆菌含量测定有着重要意义。
4. 1g检样中蜡样芽胞杆菌的计算，如，将固体检样10-4的稀释液0.1ml涂布于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板上，生成的菌落为25个，取5个鉴定，证实为蜡样芽胞杆菌者4个，则g检样中蜡样芽胞杆菌数为：
25×4/5×104×10=2×106
式中：25——0.1ml稀释液在平板上生成的菌落数；
4/5——取5个菌落进行鉴定，证实其中4个为蜡样芽胞杆菌；
104——样品的稀释倍数
10——取0.1ml换算成1ml稀释液的倍数。
（二）各种性状
1. 形态染色，蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1~1.3μm×3~5μm。芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽芽胞杆菌相似，引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力。炭疽芽胞杆菌无动力。
2. 培养特性。本菌发育温度为25~37℃，在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3~10mm，灰白色，不透明，表面粗糙。边缘不整齐，似毛玻璃状或融蜡状是其特点。炭疽芽胞杆菌菌落为粗糙型卷发状，蕈状芽胞杆菌为假根状，枯草芽胞杆菌菌落为干涩状。
蜡样芽胞杆菌在肉汤中生长混浊，微有菌膜或壁环。炭疽芽胞杆菌在肉汤内菌链成卷丝状沉淀，肉汤澄清，无菌膜。
3. 动力试验。用白金取少许培养物，由试管中心向下穿刺的方法接种于半固体普通琼脂，于30℃培养18~24h，有动力者沿穿刺线向外伸展，无动力的细菌仅在穿刺线内和沿线生长。
大多数蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌为周毛菌是有运动的。而蕈状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌是无动力的。
4. 假根样生长。在普通琼脂平板上接种菌悬液，经30℃培养48~72h，检查根样的生成，其特征为产生带有毛发样或根样结构的菌落，其根样生长物可以从接种处向外伸展达数毫米，根样生长是蜡样芽胞杆菌变种覃状芽胞杆菌的特征。
5. 卵磷脂酶和酪蛋白酶试验。将细菌分别接种于卵黄琼脂培养基或甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基及酪蛋白琼脂增基上，培养后前者生成的菌落周围有分解卵黄出现的沉淀环，表示产生卵磷脂酶。在酪蛋白琼脂上出出分解酪蛋白产生的透明圈。蜡样芽胞杆菌在上两种培基上都为明显的阳性反应。
6. 溶血现象。蜡样芽胞杆菌在血琼脂培养基生成灰绿色菌落，边缘不整，周围有溶血圈。
7. 葡萄糖（厌氧）发酵试验。将细菌接种于葡萄糖肉汤（表面覆盖石蜡油），于37℃培养，一般于第七天前即发酵产酸，使培养基变黄色。
三、培养基
（一）甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂
成分：

蛋白胨	10g
牛肉膏	1g
甘露醇	10g
氯化钠	10g
琼脂	15g
蒸馏水	1000ml
0.2%酚红溶液	13ml
50%卵黄液	50ml
多粘菌素B	100国际单位/ml
pH7.4

制法：将上面前五种成分加入于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，加入酚红溶液。分装烧瓶，每瓶100ml。121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每瓶内加入50%卵黄液5ml及多粘菌素B10000国际单位，混匀后倾注平板。
（二）酪蛋白琼脂

蛋白胨	10g
牛肉膏	3g
磷酸氢二钠	2g
氯化钠	5g
琼脂	15g
蒸馏水	1000ml
0.4%溴麝香草酚蓝溶液	12.5ml
pH7.4

制法：除指示剂外将各成分混合，加热溶解（但酪蛋白不溶解），校正pH。加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，倾注平板。
注：将菌株接种于平板上，如菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白。
（三）动力-硝酸盐培养基
成分：

蛋白胨	5g
牛肉膏	3g
硝酸钾	1g
琼脂	3g
蒸馏水	1000ml
pH7.0

制法：加热溶解，校正pH。分装试管，121℃高压灭菌15min。
（四）木糖-明胶培养基
成分：

胰胨	10g
酵母膏	10g
木糖	10g
磷酸氢二钠	5g
明胶	120g
蒸馏水	1000ml
0.2%酚红溶液	25ml
pH7.0

制法：除酚红外将各成分混合，加热溶解，校正pH。加入酚红溶液，分装试管，121℃高压灭菌15min，迅速冷却。

第二节蜡样芽胞杆菌参考检验方法

一、生化分型
1985年我国吴先先生又用淀粉水解、尿素分解、V-P反应、蔗糖发酵和脱氧核糖核酸分解5项生化项目进行分型试验，可分成32个生物型，分型率较高。
二、血清学分型
根据Taylor等（1975）研究，蜡样芽胞杆菌可按其鞭毛抗原的不同分成1~18个血清型。Gilbert和Parry（1977）又扩大了5个血清型（23个），既或23个血清型，还有40%左右的蜡样芽胞杆菌不能分型。目前我国尚无市售的蜡样芽胞杆菌分型血清。

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